一、 實驗準備
器材
液氮冷凍灌、 恒溫培養箱、 電冰箱、高壓滅菌鍋、
磁力攪拌器、
離心機、 分析天平、倒置顯微鏡、 超凈工作臺、彎頭吸管（1個）、膠頭滴管（9個）、 離心管（9個）、 帶塞培養瓶（不定個）、 試管架、 量桶、 燒杯、酒精燈、 抽濾瓶、G6型號細菌過濾漏斗、帶塞小玻璃瓶，大三角瓶 、無菌凍存管、液氮瓶
（一）、器皿
1玻璃器皿的清洗滅菌：
種類：小玻璃瓶、彎頭吸管、滴管（3個）、培養瓶、量桶、 燒杯、抽濾瓶、大三角瓶，細菌過濾器接口管
藥品：5％鹽酸溶液、重鉻酸鉀120ml、硫酸200ml、蒸餾水200ml
（1）浸泡:新使用或重復使用的玻璃器皿須經5％鹽酸溶液或自來水浸泡過夜或煮沸30min，水洗。以去除新購進玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質，并消除其弱堿性。
（
鏡頭一：實驗人員將器皿放進加有5％鹽酸溶液的盆內，并以字幕和配音的形式顯示浸泡或煮沸時間和浸泡目的）
（2）刷洗:浸泡后用軟毛刷和優質的洗潔精進行刷洗。刷洗后經行烘干
（
鏡頭二：實驗人員刷洗器皿，使用正規的清洗方法，并烘干，只示范其中2--3種即可，實驗人員必須介紹操作示范烘干箱的使用方法和相關數據的設置方法）
（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當晾干或烘干，以免造成酸浸液稀釋，影響效果。將玻璃制品完全浸泡入清潔液中24h。清潔液具有極強酸蝕作用，操作過程需戴防護用具。
（鏡頭三：帶好橡膠手套將清潔液加入到盆中，讓后進行酸浸，并以字幕的形式顯示浸泡時間）
（4）沖洗、烘干備用:浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗，吸管需沖洗10min，器皿需每瓶灌滿自來水、倒掉反復10次以上，不留任何酸浸液殘跡，然后用蒸餾水漂洗2～3次
將清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干凈透明，無油煙，不能殘留任何有害物質及化學藥品等。
（
鏡頭四：自來水沖洗，蒸餾水清洗，烘干一起完成，在這個過程中可在裝器皿的盤中放入一定量的玻璃器皿，只對其中一種進行自來水沖洗、蒸餾水清洗，洗好后就將所有儀器放入烘干箱中烘干，并在每一個步驟中以字幕或語音的形式顯示相關操作次數和時間）
（5）包裝滅菌:器材經清洗烤干或晾干后，先應嚴格包裝，然后再行消毒滅菌處理，以防止消毒滅菌后再次遭受污染。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。
（
鏡頭五：實驗人員對實驗器皿中的1—2種進行包裝示范，然后將其他包裝過的器皿一起放入高壓蒸汽滅菌鍋中進行滅菌）
（實驗人員必須示范操作高壓滅菌鍋和恒溫干燥箱的用法，示范操作步驟，只示范一次即可，在下面的不同滅菌溫度和不同滅菌時間可以字幕的形式顯示）
2、橡膠制品清洗消毒
種類：玻璃瓶橡膠塞、培養瓶瓶塞、皮管、滴管頭
新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用
（鏡頭：0.5mol/L NaOH煮沸，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘各一個鏡頭，因為在上面已經示范過干燥箱和滅菌鍋的操作方法，在使用干燥箱和高壓滅菌時只需以字幕的形式顯示烘干溫度、滅菌溫度、滅菌時間即可）
3、塑料制品的清洗消毒
種類：瓶蓋、離心管
塑料制品特點：質軟、易出現劃痕；耐腐蝕能力強、但不耐熱。
清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時，晾干備用。
（因在器皿的準備過程中玻璃制品是**主要的，故塑料制品的清洗和消毒滅菌的方法可用字幕的方法顯示出來）
（注意：各種不同材質器具的不同滅菌時間？溫度設置？）
2、試劑準備
試劑 ：RPMI l640培養液, 小牛血清（生長因子）, 胰蛋白酶液，75%乙醇（消毒）,凍存培養液（培養液7ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS緩沖液等。
重點配置的藥品：RPMI l640培養液、0.2%胰蛋白酶液。
藥品：RPMI l640 培養粉、雙蒸水、HEPES、碳酸氫鈉、青霉素、鏈霉素；typsin粉末。
器材：大三角瓶、移液槍及槍頭、無菌EP管、無菌室、無菌操作臺、
磁力攪拌器、G6型號細菌過濾漏斗、細菌過濾漏斗、冰箱。
（1）
RPMI l640基礎培養液的配制 ：
稱取RPMI l640 培養粉 10.4g溶于1,000 mL雙蒸水中,
磁力攪拌器攪拌40min. 加HEPES 2、4g。攪拌十分鐘，2g碳酸氫鈉 攪拌十分鐘 。過濾前要加雙抗 加入雙抗****終濃度為 100單位/mL。過濾
經G6型號細菌過濾漏斗抽濾后備用
1、取RPMI l640培養粉10.4g，加入1L雙蒸水于磁力攪拌器下攪拌40min
2、加入HEPES 2、4g，再次攪拌溶解10min，再加入2g碳酸氫鈉，攪拌十分鐘（每一步一個鏡頭一個配音說明即可，每一步驟6s左右時間）#p#分頁標題#e#
3、無菌實驗室打開紫外燈，紫外滅菌30min（可配音說明，6s左右）
4、人工消毒準備，無菌操作臺酒精擦拭滅菌
（
鏡頭：實驗人員穿上無菌實驗室操作服用戴上橡膠手套，然后就位用酒精棉球消毒試驗臺）
5、將滅過菌的細菌過濾器進行組裝
（
鏡頭：細菌過濾器的滅菌時間和滅菌溫度可以配音或字幕的形式顯示）
6、在無菌工作臺上在培養基中加入雙抗，并混勻，配成各100單位/ml雙抗，混合后經行細菌過濾器過濾，并示范操作
7、將滅過菌的小玻璃瓶于試驗臺上解封，取下封口紙，將小玻璃瓶瓶口于酒精燈上過火，分裝培養基，裝好后再次過火，用過火后的橡膠塞塞緊，并編號，寫上配置時間和配置人（每瓶90ml，只示范一個即可）
8、將封裝好的培養液放入4℃冰箱中存放備用。
（在這幾個步驟中每一步均以10s左右的視頻時間演示，再加上培養，然后切入下一個步驟）
（2）胰酶的配制： 稱取適量typsin粉末配制成0.1%--0.25%的濃度（0.006gtypsin粉末+3ml 雙蒸水），配制時要使用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（如D-hank's溶液），因為這些物質都會對胰酶產生抑制作用，胰酶無菌過濾時胰酶量多不銹鋼過濾，量少時用抽提過濾 。
二 、實驗臺準備，實驗人員就位
消毒劑:操作者的皮膚、培養瓶的蓋和外壁常用碘酒、酒精消毒。無菌室內桌椅和物體的消毒可用過氧乙酸、來蘇兒等擦拭或浸泡。
紫外線：主要用于消毒實驗室空氣、工作臺面和一些不能使用其他方法消毒的培養器皿。進無菌室前或做完實驗后，均應開燈照射30min進行消毒。紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細菌。
（
鏡頭：在紫外線燈照射下的超凈工作臺和實驗室一個鏡頭）
三 、復蘇細胞
原理：凍存細胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必須快速冷凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，致使細胞死亡。在凍存細胞的保存管中含有對細胞有毒害的成分DMSO,故在解凍應馬上將其去除。在冷凍活化前應在無菌臺上將細胞培養液配好，然后將保存管從液氮中取出，放于37℃的溫水中快速使細胞解凍。解凍后懸液快速移入培養液中混勻，離心去掉上清液，再加入細胞培養液。
材料：凍存的Hela細胞
器材：帶塞培養瓶、離心管（3只）、膠頭滴管（3只）、1ml移液槍、1ml移液槍頭、燒杯、酒精燈、試管架、
離心機、無菌操作臺、恒溫培養箱
藥品：RPMI l640培養液、小牛血清、酒精
鏡頭一：細胞解凍與活化（每一步為一個鏡頭）
實驗人員穿上無菌實驗室操作服用酒精噴于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭實驗臺
（1）取一離心管用滴管在其內滴加5--9ml培養液。
（2）從液氮罐中取出凍存管，并迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成。
（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液轉移入上述離心管中。
（4）低速離心(1200r／min) 6min，去上清后再用5--9ml培養液再清洗離心一次。
鏡頭二：裝瓶培養
（1）離心后去掉上清液，在離心管中滴加內滴加3ml培養液（RPMI-1640），混勻。#p#分頁標題#e#
（2）將離心管中的混合液轉移到培養瓶中，并在培養瓶中滴加15滴小牛血清（是小牛血清為10%的濃度），蓋上瓶蓋，將培養瓶平放，置于37°C培養箱中培養。
四、
傳代培養及其操作步驟
原理：細胞在體外培養時，為使其生長狀況與其在體內生長狀況相似，必須在體外模擬體內生長的環境條件。一是提供細胞存活的必須條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其他相關的生長因子，還需要氧氣、適宜的溫度、適宜的酸堿度、適宜的滲透壓，動物細胞還要加入適宜的血清。
當觀察到培養瓶中細胞鋪滿度為90%時（細胞生長處于對數期時），解凍復活成功后的細胞要進行分離培養，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養障礙，影響細胞生長。細胞由原培養瓶內分離稀釋后傳到新的培養瓶中培養的過程稱之為傳代培養。傳代細胞細胞株的**大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。
材料：培養瓶中處于對數期的Hela細胞
器材：帶塞培養瓶2—3個、離心管（3只）、膠頭滴管（3只）、彎頭滴管、1ml移液槍、1ml移液槍頭、燒杯、酒精燈、試管架、
離心機、無菌操作臺、恒溫培養箱、倒置顯微鏡
藥品：RPMI l640培養液、0.2%胰蛋白酶液、小牛血清、酒精
鏡頭一：制細胞懸液
（1）試驗臺的消毒工作準備好，盡量吸掉或倒掉培養瓶內舊培養液，以免剩余培養液影響胰蛋白酶活性。
（此處消毒同上，消毒步驟可省略不拍，以配音的方式說明在實驗前已進行試驗臺的消毒，關于細胞培養的換液再次可以做一個說明示范）
（2）向瓶內加入胰蛋白酶液1ml，置于37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，1--3min后把培養瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發現胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。
（4）吸出消化液，向瓶內用滴管加入培養液少量，輕輕轉動培養瓶，把殘留胰蛋白液消化液沖掉，然后再少量含血清的加培養液（要加多少？）。
（5）使用吸管，吸取瓶內培養液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。
（6）將準備好的細胞懸液轉入離心管中，離心(1200r／min) 6min
注意事項：
掌握好細胞消化的時間，消化時間過短時，細胞不易從瓶壁脫落，過長的消化會導致細胞脫落、損傷。若細胞沒有脫壁，生長良好，則直接倒掉消化液，加培養液5--9ml，離心收集細胞；若發現很多細胞已解離已脫壁（即解離過度），則直接加培養液進行離心收集細胞。
掌握好消化濃度，當消化液濃度過高時，消化時間應縮短，過低時細胞消化時間相對延長。
鏡頭二：細胞分裝
（1）將離心后離心管中液體倒掉，在離心管中加入3ml培養液，并反復吹打細胞，制成細胞懸液。
（2）取3個無菌培養瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精燈下過火消毒。
（3）在培養瓶中各加入1ml細胞懸液、2ml培養液（用移液槍）、15滴小牛血清，加好后酒精燈下過火加塞。
細胞培養換液時間應根據細胞生長的狀態和實驗要求來確定。一般2～3d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續傳代擴大培養或換成維持液。
五 、培養細胞的凍存
原理：細胞的凍存**常用的方法是液氮冷凍保存法，主要是加入適量的保護劑緩慢的冷凍細胞。由于細胞在不加任何保護劑的情況之下，細胞內外水分會很快結成冰晶，從而引起一系列不良反應。如細胞脫水使局部電解質濃度升高，PH值改變，部分蛋白質因此變性使細胞內部結構紊亂，溶酶體膜被破壞而放出大量酶將細胞內部結構破壞。因此在細胞凍存時的關鍵是盡可能減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成，故凍存時采用甘油或DMSO做保護劑，這兩種物質分子量較小，溶解度大，易穿透細胞，可使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，對細胞毒害作用小，梯度慢速冷凍可使細胞內水分滲出細胞外，減少形成冰晶對細胞產生的傷害。
細胞低溫凍存是培養室常規工作和通用技術。細胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。
材料：培養瓶中處于對數期的Hela細胞
器材：帶塞培養瓶2—3個、離心管（3只）、無菌凍存管、膠頭滴管（3只）、彎頭滴管、1ml移液槍、1ml移液槍頭、燒杯、酒精燈、試管架、離心機、無菌操作臺、恒溫培養箱、倒置顯微鏡、冰箱
藥品：RPMI l640培養液、0.2%胰蛋白酶液、10%DMSO、小牛血清、酒精、液氮瓶
鏡頭一：細胞懸液的制作
（1）選對數增生期細胞(細胞鋪滿度為90%左右時)，在凍存前1d換液。
（2）試驗臺的消毒工作準備好，吸掉或倒掉培養瓶內舊培養液。
（3）向瓶內加入1ml 0.25%胰蛋白酶液，以能覆蓋培養瓶底為宜。
（4）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，2--3min后把培養瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發現胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。
（5）吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，直接加入3ml培養液+15滴小牛血清，終止消化。#p#分頁標題#e#
（6）使用彎頭吸管，吸取瓶內培養液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞，按常規方法把培養細胞制備成懸液，計數，使細胞密度達左右密度
（7）將培養瓶中的細胞懸液轉移到15ml離心管中，(1200r／min) 6min，去掉上清液。
鏡頭二：凍存
（1）配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養液（培養液7ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml），于離心管中加入1ml凍存液，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，一個培養瓶中的細胞只加入一個凍存管。
（2）將細胞懸液分裝入無菌凍存管中，每管1～1.5 ml（凍存液要先預冷到4℃ ）；在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。
（3）凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增**-5℃～-10℃/ min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入液氮氣中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。
凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min時間內，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促進冰晶形成。
操作時應戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷。
