細胞培養之細胞計數

實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。
具體操作：
一.準備工作：
   取一瓶傳代的細胞，按照《傳代細胞培養（消化法）》中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以被使用.
二.細胞懸液制備：
   用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細胞懸液。
三.細胞計數：
   1.取一套血球計數板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上.
   2.制備計數用的細胞懸液：用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍染液（0.4％）或苯胺黑?；罴毎粫蝗旧尤肴疽汉缶涂梢栽陲@微鏡下區別活細胞和死細胞。
  3.將細胞懸液滴入計數板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。
  4.統計四個大格的細胞數：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，數出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數目。
  5.計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度：
細胞懸液的細胞數/ml＝（四個大格子細胞數/4)×2×10⁴
說明：/4因為計數了4個大格的細胞數；×2因細胞懸液：染液=1：1稀釋；×10⁴因為計數板中每一個大格的體積為：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm³ 而 1ml＝1000mm³  
四.細胞計數要點：
  1.進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低于10⁴個/ml，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養液中； 
  2.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。
  3.取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確；
  4.數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。
  5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。
五.初學者易犯的錯誤：
  1. 計數前未將待測懸液吹打均勻。
  2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。
  3. 滴入懸液時的量太多，**使細胞懸液流入旁邊的槽中。 
六.本實驗特殊試劑的配制：
4％臺盼藍母液：稱取4克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水**100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。
使用液：使用時，用PBS稀釋母液**0.4％即可。
細胞的凍存
1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。
2.接著置于-20℃冰箱，約30-60min。 
3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。 
4.置于液氮罐中長期保存。  
5同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。  
注意事項：
1.使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破華它的分子結構，以**于降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時**好戴上手套操作。 
2.不宜將凍存細胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發生在這一溫度區內，是“危險溫區”。
3.注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時添加。
簡便方法：
胰蛋白酶液消化>>離心>>PBS液1ml洗滌，吹打制成待測細胞懸液>>取1ul懸液+9ulPBS>>細胞計數：
1.蓋好蓋玻片：取一套血球計數板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上.
2.用10ul槍頭將細胞懸液注入計數板，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。
3.統計四個大格的細胞數：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，數出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）的細胞數目。
4.計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度：

（細胞懸液的細胞數）/ml＝（四個大格子細胞數/4)×10⁶