比較細胞工廠與10L轉瓶培養Vero細胞和產毒情況

一、實驗目的
1、了解熟悉細胞工廠的使用，清洗及再利用的方法；
2、比較細胞工廠與10L轉瓶同等條件下培養Vero細胞時各自細胞的生長狀態；
3、比較細胞工廠與10L轉瓶培養Vero細胞加毒之后細胞的狀態變化和產毒情況；
4、通過實驗分析用細胞工廠代替原有轉瓶生產優缺點；
5、通過實驗發現細胞工廠中常見問題。
二、主要實驗工具及材料
干凈的10L轉瓶一個（表面積約為2278㎝²）；
NUNC公司4層細胞工廠一個（表面積為2520㎝²，編號：140360），自帶一個插拔塞和旋口塞
細胞生長液；細胞維持液；毒種（CTN-1V株工作種子批毒種）
三、實驗過程
（一）培養Vero細胞，觀察分析及注意事項
將一瓶已長成致密單層細胞消化，制備成細胞懸液，計數后，按照每ml溶液含有1×10⁵個細胞數，及每平方厘米貼壁細胞數相同，根據面積比計算出加入ml數。加入細胞后放置于37℃恒溫室中培養。
細胞懸液濃度：2.32×10⁶個/ml
 

	溶液總體積（ml）	加入細胞懸液體積（ml）	面積細胞數（個/cm2)
細胞工廠	800	34.48
10L轉瓶	1500	31.03

 
觀察、分析
2010-8-5
11：00   加入細胞和培養液于細胞工廠和10L轉瓶中培養
13：30   觀察：細胞工廠中的貼壁細胞數量較10L轉瓶多，溶液中含有大量的懸浮細胞
分析：細胞工廠是靜置培養，細胞貼壁較10L轉瓶快
 
2010-8-6
9：10觀察
細胞工廠：細胞狀態良好，已伸展，分布均勻
10L瓶：細胞狀態一般，少許伸展，分布稍有不均
分析：10L轉瓶中的細胞貼壁不均勻，可能是由于細胞總數較少造成
 
（二）加入病毒后，Vero細胞狀態的觀察分析
2010-8-9
9：30觀察（加毒前）
細胞工廠：細胞生長成致密單層，間隙很小，排列整齊，分布均勻
10L轉瓶：細胞生長成致密單層，間隙很小，排列較整齊，分布稍有不均勻
 
加毒前更換培養液為維持液，再根據比例加入3.1ml（10L轉瓶）3.4ml(細胞工廠)病毒
 
2010-8-10  9：00觀察
細胞工廠與轉瓶中的細胞無明顯變化，狀態正常，輪廓清晰
 
2010-8-11  9：30觀察
細胞工廠與轉瓶中的細胞狀態正常，無明顯病變，無懸浮細胞；10L轉瓶的顏色稍淺
 
2010-8-12  9：00觀察
細胞工廠與轉瓶中的細胞局問成拉網狀，有少量懸浮細胞出現，并且細胞工廠中的懸浮細胞較10L轉瓶多，細胞工廠中的PH維持正常，顏色無變化，10L轉瓶的PH維持不好，顏色變化明顯，PH下降明顯。
分析：細胞工廠較10L瓶透氣性好，所以PH維持得好
 
2010-8-13  9：15觀察
細胞工廠與轉瓶中的懸浮細胞數量增多，大部分細胞病變明顯，成拉網狀
 
（三）收獲病毒液
2010-8-16  9：30收獲病毒液前觀察
細胞工廠與10L轉瓶中有大量的懸浮細胞，考慮收獲病毒液。
收獲病毒液取樣：分別從細胞工廠和10L轉瓶中取樣于青霉素小瓶中，送樣檢測抗原和感染性滴度
 
四、實驗結果分析
抗原結果和滴度結果
此次實驗結果顯示，細胞工廠制備的狂犬病毒液，抗的含量和感染性滴度均好于轉瓶工藝制備的病毒液?？赡芘c下述原因有一定關系：
（1）細胞工廠為靜止培養法，接種細胞后細胞貼壁良好，分布與較均勻，而轉瓶細胞貼壁時間較長，并且稍有不均，因此在一定時間內，細胞工廠細胞長勢稍好一些；
（2）10L瓶的細胞表面積少于細胞工廠，接種的細胞數是按面積計算，細胞工廠總細胞數多于轉瓶培養的細胞數；
（3）轉瓶工藝加毒時維持液1500ml，細胞工廠維持液是800ml。
因此，細胞工廠制備的病毒液的抗原含量和感染性滴度好于轉瓶工藝
在現有的條件下，很難找到與細胞工廠細胞生長面積和維持液體積一致的對照方法，只能以細胞附著的單位面積，加入細胞數條件控制，但維持液的量則無法控制，只能按常規方法加入。
 
細胞工廠每層液面均分操作：
1、將培養基直接倒入細胞工廠；
2、將細胞工廠朝有小口的一面放置，平衡一段時間；
3、將細胞工廠翻轉90度，帶有進液口的一面朝上，靜置一段時間，培養基便會自動平均分配到每一層腔室中；
4、雙手握住進液口的一面，緩慢地將細胞工廠放倒，變成水平放置，不要抓握**層邊緣，以防造成損壞。
 
注意事項：
1、移動細胞工廠的時候要盡量保持水平，否則會造成每層溶液不均勻；#p#分頁標題#e#
2、放置細胞工廠的平臺或架子一定要水平，防止同層的細胞溶液厚度不同；
3、由于細胞工廠的進液口是熔點低的材料制成，因此火焰保護時要小心，不要使之變形；
4、清洗細胞工廠時，如用水流沖洗，切忌用較急的水流沖洗，否則將造成細胞工廠的損壞；
5、清洗后的細胞工廠放到鏡下觀察，還可看到少量的細胞殘留在上面，不易清洗下來。根據G內其它企業的經驗，細胞工廠可重復利用3-4次，但不能高壓消毒滅菌，需要通過鈷60照射之后再利用，增加成本；
6、四層細胞工廠放到鏡下觀察時，只能看到**下一層細胞的狀態。10層或40層中細胞狀態的觀察則需要用四層細胞瓶對照觀察。
 
五、細胞工廠較現在轉瓶生產優缺點
優點：1、節省人力、物力、時間、空間；
2、方便地按比例擴增；
3、受污染風險低；
4、瓶間差異變小
缺點：1、可重復利用的次數較少；
2、產品價格較貴；
3、消毒需要用鈷60照射；
4、清洗不方便；
5、細胞工廠量較少，按二次收獲，僅收獲1600ml，而轉瓶可收3000ml；此次細胞工廠滴度較高可許與其收量低有關
 
六、總結
細胞工廠做為一個可用于大規模細胞培養的生產裝置，具有很多的方便于細胞培養的優點，會給整個生產過程節省人力，時間，空間。但是對于Vero細胞的加毒產毒過程還存在許多細胞問題。能否用于疫苗生產，還需要考慮和解決更多的難點。