軟骨細胞培養

實驗方法
Ø 各種溶液的配制
1、  配制D-Hanks液(無鈣鎂)1L，PH8-9
（1） 稱量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na₂Hpo₄.H₂o 0.06g, kH₂po₄0.06g， NaHco₃0.35g，酚紅0.02g
（2） 依次將各成分逐個溶解于800ml水中。
（3） 用5.6% NaHco₃溶解酚紅0.02克。
（4） 將酚紅液（３）加入（２）中。
（5） 補加水**1000ml，混勻。
（6） 將Hanks液分裝鹽水瓶內，110℃、8鎊高壓蒸汽消毒滅菌20分鐘，4℃冰箱保存備用。
 
2、 配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml
 （1）稱取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先將胰蛋白酶粉末調成糊狀。
   （2）補足Hanks液**75ml，攪拌混勻，置40℃水浴攪拌幫助溶解。
   （3）冷卻**室溫后，置4℃冰箱過夜。
   （4）用濾紙粗濾，再用0.22μm微孔過濾膜過濾除菌。
   （5）分裝小瓶，低溫冰箱冰凍保存備用。
 
3、 配制0.3%Ⅱ型膠原酶溶液49.5ml
（1）稱取Ⅱ型膠原酶150mg，用D-Hanks液溶解。
（2）補足Hanks液**49.5ml，攪拌混勻。
（3）用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。
（4）分裝小瓶，低溫冰箱保存備用。
 
  4、 配制閃爍液
（1）用電子天平稱取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。
（2）將上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，備用。
 
Ø 取材與培養
（1）取3kg重6月齡青紫藍兔一只(購自shou都醫科大學動物房)，兔耳靜脈注射5ml空氣致死。
（2）無菌條件下取雙側下肢膝，髖關節面軟骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪將軟骨剪碎**1mm³大小,繼續用D-Hanks液漂洗2次。
（3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO₂孵箱中消化30分鐘,中途不時搖晃。
（4） 吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型膠原酶溶液，置入37℃、5%CO₂孵箱中繼續消化3小時。每1小時更換Ⅱ型膠原酶溶液1次。用離心管留取各次消化液，離心2000rpmX10min，去除上清液。
（5） 用加了青霉素及鏈霉素的Hanks液洗1次，以同樣方法再離心一次。
（6） 過120目紗目，去除上清液。
（7） 用含10%FBS的DMEM制成細胞懸液，調細胞懸液濃度**7.5X10⁴。
（8） 將細胞懸液接種于24孔培養板（1ml）及96孔培養板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。
（9） 置于37℃、5%CO₂孵箱中培養48小時。
 
Ø 更換部分培養基
（1） 用移液槍從24孔培養板中每孔吸出0.5ml舊的培養基，更換同等數量新的培養基。
（2）同法從96孔培養板中每孔吸出100μl舊的培養基，更換同等數量新的培養基。
 
Ø 加藥
按照預前設計給培養孔中加A藥（牛膝健步）及B藥（鹿茸生長素），具體加藥方法如下圖。
具體加藥情況
    每支鹿茸生長素加1mlDMEM稀釋，PH7.0 (DMEM  PH7.2)

藥  品	培養板	大劑量	中劑量	小劑量
A藥(牛膝健步)	96孔板	10μl	8μl	6μl
A藥(牛膝健步)	24孔板	50μl	40μl	30μl
B藥(鹿茸)	96孔板	30μl	20μl	10μl
B藥(鹿茸)	24孔板	150μl	100μl	50μl

鹿茸大劑量的濃度為0.12%，中劑量的濃度為0.08%，小劑量的濃度為0.04%。
測定
Ø 測II膠原的合成
關節軟骨細胞DNA的合成用³H TdR的摻入量來檢測。
3號板加藥后48小時加同位素³H TdR及³H脯氨酸
（1）用1ml注射器抽取0.1ml ³H TdR （即0.1μci）(³H TdR及³H脯氨酸購買時濃度為    1mci/ml)。
（2） 加DMEM**0.5ml，將³H TdR配制成0.2 mci/ml濃度。
（3） 同法配制相同數量的³H脯氨酸。
（4） 根據試驗前設計，按每孔5μl（即1μci）的量加入同位素。
（5） 置于37℃、5%CO₂孵箱中培育12小時。
Ø #p#分頁標題#e#測定同位素的量
固定3號板細胞，測定同位素的量
    1、配置0.25%胰蛋白酶溶液
（1）用電子天平稱取0.25g胰蛋酶，放入燒杯內。
（2）加入少量的D-Hanks液，充分攪拌，使其成糊狀。
（3）再加入D-Hanks液**100ml，不停攪拌，直**完全溶解。
    2、固定細胞
（1）用移液管將3號板（加藥后48小時加同位素）各孔的培養液按順序吸出并置入相應的試管內。
（1） 往各孔內加入少量的0.25%胰蛋白酶溶液，并同時吹打細胞，使貼壁細胞消化脫落，消化不少于5分鐘，形成細胞懸液，將細胞懸液再依次加入上面的相應試管內。
（2） 將真空泵與玻璃纖維濾膜連接。
（3） 用滴管依次將試管中的液體吸盡，滴加在玻璃纖維濾膜上，真空抽吸過濾。
（4） 用注射器分別依次抽取2ml 5%三氯乙酸（細胞固定）、5ml蒸餾水（洗去多余的同位素）、1ml無水乙醇（細胞脫色），依次加**濾膜，使細胞固定在濾膜上。
（5） 待真空泵將濾膜上的液體吸盡后，用鑷子將濾膜取下，有序的置于托盤內。
（7）同上述3號板方法，根據試驗前設計往4號板各培養孔中加入5μl（1μci）³H TdR或³H脯氨酸，并置于37℃、5%CO₂孵箱中培育12小時。
（8） 同昨日方法固定4號板細胞。
（9）將固定3號板及4號板細胞的濾膜依次置入對應的裝有閃爍液的小塑料瓶內，閃爍 
液要覆蓋濾膜。
  3、 用美G產BECKMAN  LS6500  multi-purpose  液閃儀測定各孔細胞³H TdR或³H脯氨酸的摻入值。
Ø MTT法測細胞增殖
MTT染色
(1) 用電子天平稱量MTT染料0.02g。
（2）用DMEM溶解并稀釋**4ml，PH值測定7.2。
（3）用0.22μm濾膜過濾除菌。
（4）根據試驗前設計，往1號板與2號板相應的培養孔內，按0.1ml/孔加入MTT染色液。
（5）置于37℃、5%CO₂孵箱中培育5小時。
（6）按二甲基甲酰胺：Triton-X100：水=3：1：2的比例配置42ml脫色液（用檸檬酸調節PH**5～6）。
（7）按每孔1ml將脫色液加**1號及2號培養板相應的培養孔中。
（8）置于37℃、5%CO₂孵箱中培育3小時，期間間歇振蕩十分鐘，使結晶充分溶解。
（9）用移液槍在1號板與2號板各孔中抽吸0.2ml溶液按順序加入96板培養孔中。
（10）選擇570nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值。
Ø 甲苯胺藍染色及蛋白多糖的測定
甲苯胺藍染色
  1、試劑配制：甲苯胺藍乙醇液（甲苯胺藍0.2g溶于30%乙醇100ml中）。
  2、根據試驗前設計，將行甲苯胺藍染色的培養孔中的培養液吸去。
  3、用PBS漂洗二次。
  4、用70%乙醇固定30分鐘。
  5、用甲苯胺藍乙醇液染20分鐘。
6、倒置顯微鏡下觀察并照相。
 
由于35-硫同位素試劑**今未買到,故軟骨細胞體外培養后蛋白多糖的測定用甲苯胺藍染色法完成。軟骨2-型膠原的合成用同位素標記的脯氨酸摻入量進行檢測。
Ø 組織胺誘導軟骨細胞凋亡及吖啶橙染色
1 根據預前設計，往培養孔中加入30μl組織胺，置于37℃、5%CO₂孵箱中繼續培育24小時。
2 細胞離心，去上清后將細胞懸浮于50μlPBS中。
3 加入100μl吖啶橙染色液，混勻，置于冰中染色30分鐘。
4 加入1。85ml細胞固定液，混勻。
5 倒置顯微鏡觀察。
6 進行流式細胞儀分析。
 
 
 
 
 
 
試劑
DMEM培養基（Gibco）
      胎牛血清（FBS）：五江制藥廠
      Ⅱ型膠原酶：Sigma，北京吉泰聯科公司分裝
0.3%Ⅱ型膠原酶：取100mg膠原酶加入33ml D-Hanks液，0.22μm濾膜過濾；
DMEM培養液：90mlDMEM+10mlFBS+0.1ml青霉素+0.1ml鏈霉素
青霉素160萬^u加Hanks16ml，即10萬^u/ml
鏈霉素100萬^u加Hanks10ml，即10萬^u/ml
Trypsin（胰蛋白酶）：Gibco，邦定分裝
0.25%Trypsin：0.125g Trypsin加入50ml D-Hanks液中
 
實驗過程
 
2002年12月13日   星期五
一、 配制D-Hanks液(無鈣鎂)1L，PH8-9
1、 稱量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na₂Hpo₄﹒H₂o 0.06g, kH₂po₄0.06g，NaHco₃0.35g，酚紅0.02g
2、 依次將各成分逐個溶解于800ml水中。
3、 用5.6% NaHco₃溶解酚紅0.02克。
4、 將酚紅液（３）加入（２）中。
5、 補加水**1000ml，混勻。
6、 將Hanks液分裝鹽水瓶內，110℃、8鎊高壓蒸汽消毒滅菌20分鐘，4℃冰箱保存備用。
 
二、 配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml
1、 稱取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先將胰蛋白酶粉末調成糊狀。
2、補足Hanks液**75ml，攪拌混勻，置40℃水浴攪拌幫助溶解。
3、冷卻**室溫后，置4℃冰箱過夜。
4、用濾紙粗濾，再用0.22μm微孔過濾膜過濾除菌。
5、分裝小瓶，低溫冰箱冰凍保存備用。#p#分頁標題#e#
 
三、 配制0.3%Ⅱ型膠原酶溶液49.5ml
1、 稱?、蛐湍z原酶150mg，用D-Hanks液溶解。
2、 補足Hanks液**49.5ml，攪拌混勻。
3、 用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。
4、 分裝小瓶，低溫冰箱保存備用。
 
四、 取材
1、 取3kg重6月齡青紫藍兔一只(購自shou都醫科大學動物房)，兔耳靜脈注射5ml空氣致死。
2、 無菌條件下取雙側下肢膝，髖關節面軟骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪將軟骨剪碎**1mm³大小,繼續用D-Hanks液漂洗2次。
3、 吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO₂孵箱中消化30分鐘,中途不時搖晃。
4、 吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型膠原酶溶液，置入37℃、5%CO₂孵箱中繼續消化3小時。每1小時更換Ⅱ型膠原酶溶液1次。用離心管留取各次消化液，離心2000rpmX10min，去除上清液。
5、 用加了青霉素及鏈霉素的Hanks液洗1次，以同樣方法再離心一次。
6、 過120目紗目，去除上清液。
7、 用含10%FBS的DMEM制成細胞懸液，調細胞懸液濃度**7.5X10⁴。
8、 將細胞懸液接種于24孔培養板（1ml）及96孔培養板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。
9、 置于37℃、5%CO₂孵箱中培養48小時。
 
2002年12月6日    星期一
一、 更換部分培養基
1、 用移液槍從24孔培養板中每孔吸出0.5ml舊的培養基，更換同等數量新的培養基。
2、 同法從96孔培養板中每孔吸出100μl舊的培養基，更換同等數量新的培養基。
二、 加藥：按照預前設計給培養孔中加A藥（牛膝健步）及B藥（鹿茸生長素），具體加藥方法如下圖。
具體加藥情況
    每支鹿茸生長素加1mlDMEM稀釋，PH7.0 (DMEM  PH7.2)

藥  品	培養板	大劑量	中劑量	小劑量
A藥(牛膝健步)	96孔板	10μl	8μl	6μl
A藥(牛膝健步)	24孔板	50μl	40μl	30μl
B藥(鹿茸)	96孔板	30μl	20μl	10μl
B藥(鹿茸)	24孔板	150μl	100μl	50μl

鹿茸大劑量的濃度為0.12%，中劑量的濃度為0.08%，小劑量的濃度為0.04%。
 
 
 
 
 
 
 
2002年12月17日      星期二
一、 配制閃爍液
1、 用電子天平稱取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。
2、 將上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，備用。
 
2002年12月18日      星期三
一、 3號板加藥后48小時加同位素³H TdR及³H脯氨酸
1、 用1ml注射器抽取0.1ml ³H TdR （即0.1μci）(³H TdR及³H脯氨酸購買時濃度為1mci/ml)。
2、 加DMEM**0.5ml，將³H TdR配制成0.2 mci/ml濃度。
3、 同法配制相同數量的³H脯氨酸。
4、 根據試驗前設計，按每孔5μl（即1μci）的量加入同位素。
5、 置于37℃、5%CO₂孵箱中培育12小時。
 
2002年12月19日    星期四
一、 MTT染色
1、 用電子天平稱量MTT染料0.02g。
2、 用DMEM溶解并稀釋**4ml，PH值測定7.2。
3、 用0.22μm濾膜過濾除菌。
4、 根據試驗前設計，往1號板與2號板相應的培養孔內，按0.1ml/孔加入MTT染色液。
5、 置于37℃、5%CO₂孵箱中培育5小時。
6、 按二甲基甲酰胺：Triton-X100：水=3：1：2的比例配置42ml脫色液（用檸檬酸調節PH**5～6）。
7、 按每孔1ml將脫色液加**1號及2號培養板相應的培養孔中。
8、 置于37℃、5%CO₂孵箱中培育3小時，期間間歇振蕩十分鐘，使結晶充分溶解。#p#分頁標題#e#
9、 用移液槍在1號板與2號板各孔中抽吸0.2ml溶液按順序加入96板培養孔中。
10、 選擇570nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值。
 
 
二、 固定3號板細胞，測定同位素的量
（一） 配置0.25%胰蛋白酶溶液
1、 用電子天平稱取0.25g胰蛋酶，放入燒杯內。
2、 加入少量的D-Hanks液，充分攪拌，使其成糊狀。
3、 再加入D-Hanks液**100ml，不停攪拌，直**完全溶解。
（二） 固定細胞
1、 用移液管將3號板（加藥后48小時加同位素）各孔的培養液按順序吸出并置入相應的試管內。
2、 往各孔內加入少量的0.25%胰蛋白酶溶液，并同時吹打細胞，使貼壁細胞消化脫落，消化不少于5分鐘，形成細胞懸液，將細胞懸液再依次加入上面的相應試管內。
3、 將真空泵與玻璃纖維濾膜連接。
4、 用滴管依次將試管中的液體吸盡，滴加在玻璃纖維濾膜上，真空抽吸過濾。
5、 用注射器分別依次抽取2ml 5%三氯乙酸（細胞固定）、5ml蒸餾水（洗去多余的同位素）、1ml無水乙醇（細胞脫色），依次加**濾膜，使細胞固定在濾膜上。
6、 待真空泵將濾膜上的液體吸盡后，用鑷子將濾膜取下，有序的置于托盤內。
 
三、 同昨日3號板方法，根據試驗前設計往4號板各培養孔中加入5μl（1μci）³H TdR或³H脯氨酸，并置于37℃、5%CO₂孵箱中培育12小時。
 
四、甲苯胺藍染色
1、試劑配制：甲苯胺藍乙醇液（甲苯胺藍0.2g溶于30%乙醇100ml中）。
2、根據試驗前設計，將行甲苯胺藍染色的培養孔中的培養液吸去。
3、用PBS漂洗二次。
4、用70%乙醇固定30分鐘。
4、 用甲苯胺藍乙醇液染20分鐘。
5、 倒置顯微鏡下觀察并照相。
 
2002年12月20日       星期五
一、 同昨日方法固定4號板細胞。
二、 將固定3號板及4號板細胞的濾膜依次置入對應的裝有閃爍液的小塑料瓶內，閃爍液要覆蓋濾膜。
三、 用美G產BECKMAN  LS6500  multi-purpose  液閃儀測定各孔細胞³H TdR或³H脯氨酸的摻入值。
 
 
 
 
 
 
[題名]人關節軟骨細胞培養法的改良及其特有表型的檢測
[外文題名]The modified chondrocyte culture method and inspection of cell's pheno
type
[作者]宋衛東, 劉尚禮, 李衛平, 沈慧勇, 黃東生, 黃建榮
[單位]廣東 廣州中山大學附屬第二醫院骨科 510120
[出處]中華實驗外科雜志 2003V20N2 147-148
[資助]G家自然科學青年基金資助項目 (30100188)
[關鍵詞]軟骨細胞, 培養, 表型
[摘要]目的:探討簡便、易行的人關節軟骨細胞體外培養方法。方法:以0.25%胰酶消化軟骨塊
0.5 h,0.30%膠原酶消化4 h后,將軟骨細胞與小片軟骨(0.2 mm^3|大小)共同置入預涂多聚賴氨
酸的培養瓶中培養;與傳統方法對照,用倒置顯微鏡、免疫組織化學、電鏡、逆轉錄-聚合酶鏈
反應(RT-PCR)等方法，檢測經7次傳代后軟骨細胞表型改變相伴隨的形態學及分子生物學特征
。結果:改良法培養的細胞活性率可達100%。經多次傳代的軟骨細胞仍保持原代軟骨細胞的表
型特征,甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色陽性,并可觀察到軟骨的特有的細胞-膠原
纖維幾何構像。而傳統法培養的軟骨細胞在第7代特有表型出現改變。結論:本改良法是一種較
方便而且有效的培養法。
[參考文獻]4
[題名]軟骨細胞凋亡與骨關節炎
[作者]向川
[單位]湖北 武漢華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院骨科 430022
[出處]G外醫學·免疫學分冊 2003V26N2 110-封三
[關鍵詞]軟骨細胞, 凋亡, 骨關節炎
[摘要]骨關節炎(OA)是一種老年人常見的關節疾患,近年研究顯示,軟骨細胞過度凋亡可能在
OA的發病中產生了重要影響。在OA中,軟骨細胞凋亡多通過NO途徑和Fas途徑發生,并且受IL-1
β、TNF-α、IL-8、bcl-2等因素的影響。闡明軟骨細胞凋亡在OA的發病機制中的作用,將有助
于OA的防治。
[文獻類型]綜述